敲黑板！！！His標(biāo)簽融合蛋白純化常見問題和解決方案全收納

His標(biāo)簽融合蛋白的純化是借助于層析介質(zhì)上的過渡金屬離子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）與His融合蛋白上的His標(biāo)簽的配位作用實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的分離。組氨酸（His）的殘基上帶有1個(gè)咪唑基團(tuán)，可以和Ni2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬離子上，這些金屬離子通過螯合配體固定在層析介質(zhì)上，因此帶有His標(biāo)簽的蛋白可以特異性的吸附在螯合了Ni2+等過渡金屬離子的層析介質(zhì)上，而其他不含His標(biāo)簽的雜質(zhì)蛋白則不能吸附或僅微弱吸附在介質(zhì)上。通過提高緩沖液中的咪唑濃度進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫，可以將His標(biāo)簽融合蛋白從層析介質(zhì)上解吸附下來，從而得到較高純度的目標(biāo)蛋白。

常用的His標(biāo)簽融合蛋白純化的填料有Ni Tanrose 6FF（NTA/IDA）金屬螯合親和填料，但是在使用過程這種常常會(huì)出現(xiàn)一些問題，這里就給各位老師介紹下常見問題和解決方案

填料清洗

當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)反壓過高或者填料上面出現(xiàn)明顯的污染時(shí)，需要進(jìn)行在位清洗操作 （Cleaning-in-Place，CIP）。

建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過使用 30%異丙醇清洗 5-10 個(gè)柱體積，接觸時(shí)間為 15-20 分鐘可以去除此類污染物。然后，再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液， 清洗填料 2 倍柱體積。例如，含有 0.1–0.5% 非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液，接觸時(shí)間 為 1–2 小時(shí)。去污劑處理后，需要使用 70%的乙醇清洗 5 個(gè)柱體積，以*去除去污劑。后使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。

去除離子作用結(jié)合的蛋白

使用 1.5M NaCl 溶液接觸時(shí)間為 10-15 分鐘清洗。然后，再使用去離子水清洗 10 個(gè)柱體 積。

填料再生

組氨酸標(biāo)簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子。當(dāng)填料使 用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺，或者填料載量明顯變低時(shí)，需要進(jìn)行對(duì)填料進(jìn)行鎳離子剝離和重新 掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi)，按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子 剝離和重新掛鎳離子。

1) 使用 0.2 M 醋酸溶液（含 6 M GuHCl）清洗 2 倍柱體積；

2) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積；

3) 使用 2% SDS 清洗 3 倍柱體積；

4) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積；

5) 使用乙醇清洗 5 倍柱體積；

6) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積；

7) 使用 100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體積；

8) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積；

9) 使用 100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體積；

10) 使用去離子水清洗 10 倍柱體積；填料再生后，可以立即使用，也可以保存在 20%的乙醇中，置于 4°C 保存。