液相色譜，你問我答（四）

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我們的《液相色譜，你問我答》已經發布三期了您困惑的問題，還有沒出現的嗎？如果有，那就快來看看這次有您想要的答案嗎~

Q1 我聽說有正相色譜和反相色譜，我想了解下什么是正相色譜？什么是反相色譜？它們有什么區別呢？

答：其實正相色譜和反相色譜是由流動相和固定相極性大小差異來分類的，通常正相色譜固定相極性比流動相極性大，常用的流動相有正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等。而反相色譜剛好相反，是流動相極性比固定相極性極性大，常用的流動相有甲醇、乙腈、四氫呋喃、水等。反相色譜是目前Z通用的HPLC方法，大約95%的色譜工作者都在使用。

Q2 那我手上有一根色譜柱，我怎么知道是使用于反相色譜還是正相色譜呢？

答：目前來說，常用的反相填料有：C18、C8、C4 和苯基等；正相填料有：硅膠、氨基、氰基、二醇基等。

Q3 我通常看到有不同長度和內徑的色譜柱，我能了解下色譜柱的長度和內徑不同對我的色譜分析有什么影響呢？

答：對于色譜柱的長度和內徑，我們可以基于我們需要分析的物質的復雜程度來選擇，兩支同填料的色譜柱，柱長越短，分離時間越快，但柱越長分辨率將會更好，同時壓力也將更大，可結合樣品的復雜性和希望分離的時間來選擇合適的柱長。對于色譜柱的內徑，窄徑柱可提高柱的靈敏度，并可明顯降低溶劑的使用量；寬徑柱可以將系統死體積的影響降到Z低，載樣量高，抗污染。下表可供我們選擇色譜柱時對柱內徑的一個選擇。

Q4 那我想用不同內徑和長度的柱子來進行色譜方法轉移，我該怎么調整色譜條件呢？

答：對不同內徑和長度的色譜柱，我們可以使用以下方法來轉換進樣量和流速：

Q5 我在看色譜柱的使用說明書中，通常都會提到柱體積，那我怎么計算我手上色譜柱的柱體積呢？

答：基本上色譜柱的柱體積計算公式都差不多，這里列舉月旭色譜柱柱體積計算：
以4.6mm×150mm的柱子為例：
柱管體積=πr2L=π×(0.23)2×15=2.49cm2=2.5ml
2.5ml×70%(沒有填裝的體積)=1.75ml=1個柱體積 

Q6 現在色譜填料的粒徑也有很多種，那我在色譜分析工作中，該怎么選擇色譜柱的中填料的粒徑呢？

答：目前市場上主要可供選擇的分析用填料粒徑主要有以下幾種：
1.7μm、1.8μm、 2.2μm-----快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀
3.0μm、3.5μm-----快速液相色譜柱：普通快速分析
5μm-----常規分析
其中5μm的粒徑是Z常用的，但是這里是指平均粒徑是5μm，也有可能有3μm和5μm粒徑的填料。
當然色譜填料的粒徑越小，理論塔板高度越低，相應的柱效越高，分離度和靈敏度就越好，而且在高線速度區域，柱效的降低也得于緩和；但是壓力會成倍上升。通常我們會結合色譜柱的長度來綜合選擇色譜柱的粒徑，下表可作為色譜柱填料粒徑選擇的一個參考。

Q7 那色譜填料的孔徑，我在測定什么樣的產品需要考慮呢？

答：現在多孔填料的 95%以上表面積在孔內部，這樣只有分析目標物進入孔內，才能達到分析分離的目的。而只有樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進入微粒內部。對于小分子的反相分離，選擇小孔徑（60? ~120?）填料柱，對于小分子和多肽，使用100? ~150?，而只有當目標物的分子量大于2000 時我們才會選擇300?孔徑的填料。 

Q8 那填料的比表面積對我的分析物之間有什么關系呢？

答：每克填料的比表面積與孔徑和粒徑有關，隨著孔徑的增加，比表面積降低。目前比表面積一般為：180m2/g-350m2/g，隨著比表面積增大，保留增加，載樣量增加，平衡時間增加（梯度洗脫尤為注意）。我們在日常色譜分析工作中可根據需要選擇合適的比表面積。

Q9 我在日常的色譜分析中，經常看到色譜條件中提到色譜柱的封尾，什么色譜柱的封尾？為什么要封尾呢？

答：由于空間位阻的存在，鍵合反應最多只能覆蓋 50%的硅羥基，超過一半硅羥基是活性硅羥基，與堿性基團會發生離子交換作用，增加了保留，導致峰形拖尾，用短鏈氯硅烷（如三J基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小這種影響，這種操作被稱為封尾，封端，封口。

Q10 封尾與不封尾的色譜填料有什么區別呢？

答：封尾消弱硅羥基作用；不封尾提高硅羥基影響，增強極性物質的保留，降低柱流失，但是有些物質會在不封尾的柱子上產生拖尾。