Co柱常見問題及解決方案

在水溶液中，過渡金屬離子（如Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺和Co²⁺）與組氨酸和半胱氨酸間具有親和作用，IMAC正是以此親和力為基礎(chǔ)。將此方法延伸應(yīng)用，使金屬離子“強(qiáng)固定"于載體達(dá)到蛋白質(zhì)分級(jí)分離的目的。

應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用目的選擇固定于IMAC配基的金屬離子。三價(jià)陽(yáng)離子，如Al³⁺、Ga³⁺和Fe³⁺或四價(jià)Zr⁴⁺更適合捕獲磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化肽，二價(jià)Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Co²⁺常用于純化His標(biāo)記蛋白質(zhì)。聯(lián)合使用四配位配基，可以確保固定化牢固，而且金屬離子（Ni²⁺、Co²⁺）保留兩個(gè)自由配位鍵與生物高分子相互作用時(shí)，接受能力更高，同時(shí)回收率和洗脫蛋白質(zhì)純度無明顯變化。

月旭金屬螯合親和介質(zhì)主推Ni（NTA/IDA）、Co（NTA），今天主要介紹下Co Tanrose 6FF（NTA）的基本參數(shù)與常見問題。

• Co Tanrose 6FF （NTA）

Co Tanrose 6FF（NTA）是以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，氨三乙酸偶聯(lián)于瓊脂糖而成，之后螯合Co²⁺。鈷NTA瓊脂糖凝膠FF特異性好，螯合鈷更穩(wěn)定，不易脫落，能耐受更高的還原劑，物理和化學(xué)穩(wěn)定性好。

• 產(chǎn)品參數(shù)

解決方案：①裂解液中含有微小的固體顆粒，建議上柱前使用濾膜（0.22或0.45μm）過濾，或者離心去除。

②樣品中含有高濃度的核酸，加長(zhǎng)破碎時(shí)間直至粘度降低，或者添加DNase I（終濃度5μg/ml），Mg²⁺（終濃度1mM），冰上孵育10-15分鐘。

2、樣品太粘稠

解決方案：有機(jī)溶劑或者蛋白穩(wěn)定試劑（如甘油等）可能會(huì)引起反壓增高，降低操作流速。

解決方案：可以通過電泳檢測(cè)裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵體蛋白需要按照包涵體蛋白的純化方式。

2、表達(dá)量太低

3、目的蛋白結(jié)合比較弱，在洗雜步驟被洗下來了

解決方案：提高Wash Buffer的pH，或者降低咪唑濃度。

4、目的蛋白結(jié)合過強(qiáng)，不容易洗脫下來

解決方案：降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑濃度。

5、蛋白降解

解決方案：菌體破碎時(shí)添加一些蛋白酶抑制劑。在4°C下進(jìn)行純化操作。 

解決方案：增加Wash Buffer體積。

2、樣品中含有其他的組氨酸標(biāo)簽蛋白

解決方案：通過調(diào)節(jié)pH值，或者咪唑濃度來優(yōu)化洗雜條件。再使用其他的純化手段（如離子交換、疏水等）進(jìn)一步純化洗脫組分。

解決方案：適當(dāng)降低還原劑DTT的濃度，或者改用巰基乙醇。

解決方案：室溫下進(jìn)行上樣。

2、蛋白發(fā)生聚集

解決方案：在樣品和所有的緩沖液中添加穩(wěn)定劑，如0.1%的TritonX-100或者Tween-20。

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