凝膠柱的選擇與凝膠的預處理

在選擇凝膠柱時，從外觀、質地結構和性能來講，所選柱子要透明光滑，內徑一致，耐壓防腐，柱子物料須生物兼容，并有良好的物理化學抗性和穩(wěn)定性。一般的柱材料多為玻璃或有機玻璃，在使用鋼柱時，特別要注意防腐蝕。另外，柱子終端要有采集器和過濾網，柱底板要求耐壓且不容易堵塞。死體積應小于0.001Vt，如果死體積過大，被分離組分可能會重新混合，導致洗脫峰出現拖尾現象，降低分辨率。底板過濾介質要求新，且?guī)в心芘c凝膠融合的網孔，避免接觸網孔和過濾介質的表面，因為指紋會使樣品的分離程度下降。在裝柱或重新裝柱時，所有部位必須*清洗干凈。

凝膠柱的長度和內徑主要取決于加樣體積的多少和對分辨率的要求。凝膠柱的長度對分辨率的影響較大，長柱的分辨率要比短柱的高，但過長會引起柱內不均一、liu速過慢，柱長度一般不超過100cm。同時，也要有適當的柱內徑，內徑過粗會產生蛋白樣品較為嚴重的橫向擴散現象，內徑過細，靠近柱內壁的流速會大于中心的流速，產生“器壁效應"，影響分離速度和效果。通常使用的凝膠柱長度在25-70cm，內徑在4-16mm，H/D（高徑比）一般在 （25:1）-（100:1）之間。用于組別分離的凝膠柱，其H/D 可相對低一些；進行分級分離時H/D可在（30:1）-（100:1）；而脫鹽柱由于對分辨率的要求較低，一般用短柱，H/D大多在（5:1）-（25:1）之間。如果要分離的蛋白質分子量相差較大，可選用H/D=（15:1）-（50:1）的柱子，且柱體積要大于4-15倍的樣品體積；如要分離的蛋白質分子量差異較小，則選用H/D=（20:1）-（100:1）的細柱，且柱體積要大于25-100倍的樣品體積。在純化蛋白質時，為了得到較好的分辨率，柱子的H/D 應在（20:1）-（40:1）。

此外，選擇柱子時還應考慮凝膠顆粒的大小。如填裝小顆粒凝膠，適合使用較大直徑的色譜柱；用粗顆粒填裝時，則用較小直徑的柱子。

市售凝膠一般呈干粉顆粒狀（如 Tandex） 或水懸浮狀 （如Tanrose CL）。一些不宜在脫水干燥狀態(tài)下保存的凝膠 （如瓊脂糖凝膠），應存放在含防腐劑的水溶液中，這些凝膠在使用前不需要進行溶脹處理。另外，多孔硅膠和多孔玻璃也不需要溶脹處理。為了盡量減少不同溶劑對柱床體積的影響，獲得理想的分離效果，應將干膠緩慢倒入5-10倍干膠體積的洗脫液中充分溶脹。若溶脹不夠，則達不到有效的分離，而且在使用過程中會引起凝膠柱破裂。

根據蛋白質樣品的分子量和分辨率要求選擇好所用凝膠的類型后，再根據柱體積和凝膠的吸水性質估算出干膠的用量。由于凝膠在預處理和實驗操作過程中有一定量的損失，所以在實際稱取時應高于理論計算值的10%-20%。