色譜雙峰大排查

色譜雙峰指的是同一種物質，在色譜圖中表現出雙峰，讓我們誤以為是兩種物質。那為什么會出現這種情況，在實驗過程中又該怎么避免，今天小編就和大家一起來聊一聊。

在HPLC分析中，在色譜柱正常、樣品濃度適宜、分析方法合適、色譜峰在出峰時間較短的情況下，峰形應是一個高斯峰型，對稱而尖銳的。然而在實際操作中，如果對樣品性質不了解，前處理不恰當或者分析方法不合理時，就會出現峰形不正常的情況，其中雙峰現象是液相色譜常見的問題之一。出現色譜雙峰的原因一般有以下幾種：

如果在分析樣品時發現每個色譜峰都是雙峰，尤其是分析單一純物質時，則可以確定是色譜柱出現問題了，一般是柱頭受損引起的。如果進樣量少，原來色譜峰正常，峰形多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾時，應考慮是柱頭端被堵塞，可以將色譜柱反接（月旭的色譜柱可以反沖），用流動相或酸或其他有機溶劑沖洗，將堵在柱頭端的物質沖掉后，再正接測試，通常會有改善。當然也可以不反沖，正沖有時也有效果。

如果雙峰強弱相差不大，柱頭端填料變臟或柱流失的可能性更大，這時可以把柱頭擰開，將篩板取下超聲，柱頭端刮去被污染的填料，填上新填料后再擰緊，不過這個最好是由專業人員操作且不能經常做，否則用不了幾次，色譜柱就會應柱效降低而報廢。如果上述操作仍不能解決問題，則可能是柱塌陷造成的，需要更換色譜柱。

目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加入各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解，最佳的溶解方法是用流動相溶解。在實際分析中，有時候為了樣品的溶解性或穩定性加入了一定的緩沖液，緩沖液的酸堿性可能會導致樣品轉化，從而產生雙峰現象。此時需要更換緩沖液，調整溶劑pH值，或者用流動相配置樣品。

此外，樣品要現配現用，避免因樣品溶解液的有機相比例、pH值發生變化而導致的溶劑效應。

當用溶劑極性強度大的試劑溶解樣品，如甲醇、乙腈、乙醇等，而分析體系以水為主時，如果樣品進樣量大，比如進20μL，此時目標物會出現雙峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一樣)，且拖尾，保留時間會提前(相對進樣量少而言)，將進樣量減少一半以上，峰型將變為正常。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的，這種情況下需要減少進樣量或者用流動相溶解樣品。

另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由于進樣量過大，色譜柱過載造成的。

體系pH值對色譜雙峰的影響出現在各個環節上，尤其在緩沖液流動相平衡過程中其影響更為明顯。當連續進樣時，受pH的連續變化影響會經常遇到這種雙峰的情況。另外，在樣品分析時，流動相的pH盡量遠離被分析物的等電點，否則也容易引起產生雙峰。在用離子對試劑分析時，液相條件沒選擇好也會引起雙峰。

有些樣品由于其化學結構的特點，存在異構體。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下，其質譜的總離子流圖（TIC）上較明顯，如啶蟲脒。

參比波長設置錯誤，例如設置分析波長254nm，參比波長400nm，這個對于大多數化合物可能沒影響。但是如果被測化合物，在400nm處也有強的紫外吸收，比254nm更高。這樣其出峰時，由于背景的抵扣作用，本來一個峰會變成對稱的二個峰，而且如果將二峰之間的峰谷反轉180度，恰好是一個完整的峰。這時要將參比波長設置更大，或者取消。

當然，如果儀器存在較大死體積，也可能會導致雙峰出現。

在對樣品不夠了解，分析方法不當，樣品處理方法及進樣方式不合理情況下，會出現各種意想不到的問題，也很難對色譜峰作出合理的解釋，尤其對于新手更是如此，所以，了解每種異常出現的原因，并根據原因采取合理的改進措施，是避免異常峰出現的*的辦法。