一山怎能容二虎？色譜雙峰

俗話說的好，一山怎能容二虎？在我們日常實驗時，這個道理也同樣適用。有實驗經驗的小伙伴都知道，在HPLC分析中，如果色譜柱性能正常，樣品濃度適宜，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下，峰型應對稱而尖銳，如下圖1所示。 

（圖1）

（圖2）

如果色譜柱在使用過程中發現每個峰的峰形都出現問題，先考察是否有連接問題。管線可能太長或太短，這種情況可能導致滲漏或峰分叉/拖尾。如果管線太長，密封圈位置不當，將發生滲漏。如果管線推出的距離不夠，將會產生一段死空間，形成混合腔，導致柱外體積，使峰形變壞。

如果在樣品分析時發現每個色譜峰都有雙峰出現，尤其在采用單一純物質時，所有的接頭都是正常連接，則可以確定是色譜柱出現問題了，一般是柱頭受損或者柱頭固定相污染引起的。

如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當然不反沖，正沖有時也會正常的。

如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，建議按照說明書進行日常或異常的再生沖洗。如果沖洗無法改善出峰情況，建議聯系色譜柱廠商進行排查或維修。

如果樣品基質比較臟，使用一段時間之后，發現的峰分叉或拖尾等問題，很有可能是保護柱失效造成的。一般粗略判斷標準，塔板數、壓力或分離度的改變超過10%，就需要更換保護柱了。保護柱是消耗品，建議直接更換，不需要再生。 

當用溶劑極性強度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主時，如果樣品進樣量大，如定量管為20μL，此時單一的純物質會出現雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進樣量少而言），將進樣量減少一半以上，峰型將變為正常。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的溶劑效應問題，該情況的異常建議用流動相作為稀釋劑或減少進樣量以消除溶劑效應。

另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由于進樣量過大，色譜柱過載造成的。

目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解，最佳的溶解方法是用流動相溶解。在實際分析中，有時候為了樣品的溶解性或穩定性加入了一點的緩沖液，緩沖液的酸堿性可能會導致樣品轉化，從而產生雙峰現象。此時需要更換緩沖液，調整溶劑pH值，或者用流動相配置樣品。

此外，樣品要現配現用，避免樣品溶解液的有機相比例、pH值發生變化而導致的溶劑效應。

有些樣品由于其化學結構的特點，存在互變異構現象，而這種互變異構體無法分開，而是以一個動態平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下（如pH值、流動相極性、溫度等），一種物質將出現雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現象將消失。

體系pH值對色譜雙峰的影響出現在各個環節上（前面已經提到），尤其在緩沖液流動相平衡過程中其影響更為明顯。當連續進樣時，受pH的連續變化影響會經常遇到這種雙峰的情況。另外，在樣品分析時，流動相的pH盡量遠離被分析物的等電點，否則也容易引起雙峰的產生。在用離子對試劑分析時，選擇不好條件也會容易引起雙峰的產生。