如何讓你的HPLC數(shù)據(jù)質(zhì)量及重現(xiàn)性臻于完美？

01 試劑質(zhì)量

梯度洗脫比較容易在柱頭端累積A和B溶劑中的非極性雜質(zhì)，會(huì)在隨后的梯度過程中逐漸釋放這些雜質(zhì)。這些雜質(zhì)有可能在空白樣品和實(shí)際樣品的測(cè)試過程中出現(xiàn)。出于這個(gè)原因我們有必要在進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)的時(shí)候使用HPLC級(jí)別的試劑。低質(zhì)量的試劑可能適用于等度洗脫，但是在梯度洗脫中，即便是最微不足道的雜質(zhì)也可能會(huì)造成測(cè)試異常的問題。為了獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們應(yīng)該確保在所有的HPLC實(shí)驗(yàn)中只使用HPLC級(jí)別的試劑。

水性試劑和緩沖液應(yīng)該經(jīng)常更換，這樣可以避免微生物生長而造成的污染，水中的雜質(zhì)尤其會(huì)造成很多問題。

02 系統(tǒng)的清潔

和試劑的質(zhì)量一樣重要，保持儀器清潔有助于減少鬼峰的出現(xiàn)，建議勤沖儀器。如果遇到其他問題，如液體溢出、漏液和其他潛在的污染源都應(yīng)該及時(shí)得到清理。

03 除氣

雖然一些HPLC系統(tǒng)在流動(dòng)相沒有除氣的情況下也可以運(yùn)行，但是采用除氣后的溶劑會(huì)使所有系統(tǒng)的運(yùn)行都變得更可靠。殘存的氣泡和溶劑中氣體溢出的現(xiàn)象，都可以通過對(duì)溶劑的除氣而大量避免。

另外，HPLC系統(tǒng)中也會(huì)有殘存氣體，每天都沖洗泵和溶劑的入口管線，不失為一個(gè)好主意。我們可以通過開啟purge閥和以較高的流速（例如5mL/min）對(duì)泵進(jìn)行幾分鐘的沖洗來移除泵和管線內(nèi)的氣泡。

04 專用的色譜柱

每個(gè)分析方法都應(yīng)該有一根專用色譜柱。在不同的方法之間共用一根柱子并不是一個(gè)好主意，因?yàn)橐粋€(gè)方法中無關(guān)緊要的色譜峰可能會(huì)變成第二種方法中的干擾峰。樣品成分可能會(huì)導(dǎo)致色譜柱的填料選擇性發(fā)生改變，或者其中一個(gè)方法造成柱子的退化。

05 平衡

在每次實(shí)驗(yàn)之前，柱子應(yīng)該恢復(fù)平衡到同樣的程度，為后續(xù)的分離實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。wan全平衡對(duì)于梯度洗脫來說是十分必要的。

06 初始進(jìn)樣

如果在第一次進(jìn)樣之前，進(jìn)行幾次“初始”進(jìn)樣，那么一些方法就可以獲得更好的結(jié)果。這些標(biāo)準(zhǔn)品或者模擬樣品的進(jìn)樣，可以飽和色譜柱上緩慢平衡的活性部位，因此可以獲得重現(xiàn)性更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。初始進(jìn)樣對(duì)于分離生化樣品更有用。有時(shí)候系統(tǒng)適用性進(jìn)樣也可以用作初始進(jìn)樣。

07 忽略第一次進(jìn)樣

因?yàn)橐恍┓椒ㄒ笫褂贸跏歼M(jìn)樣的程序，而且第一次進(jìn)樣的平衡狀態(tài)可能和隨后進(jìn)樣的不一致；因此最好避免使用第一次進(jìn)樣做定量分析。第二次和隨后的進(jìn)樣比第一次進(jìn)樣更加可靠；在正式進(jìn)樣之前展開的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)也能用于這個(gè)目的。

08 系統(tǒng)適用性

很多在監(jiān)管部門（FDA、EPA、OECD、USP等）監(jiān)管下的方法都要求在分析樣品之前做一個(gè)系統(tǒng)適用性的測(cè)試。系統(tǒng)適用性有助于確認(rèn)設(shè)備和分析方法能夠產(chǎn)生可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

系統(tǒng)適用性測(cè)試的要求各有不同，所以相關(guān)人員應(yīng)該咨詢有關(guān)的法規(guī)指導(dǎo)來幫助選擇合適的測(cè)試方法，很多操作者使用保留時(shí)間和峰面積的重現(xiàn)性、色譜峰的響應(yīng)（檢測(cè)敏感度）、峰寬、色譜峰的拖尾、分離度和柱壓，這些其中一種或者綜合的方法，作為系統(tǒng)適用性測(cè)試的一部分。

系統(tǒng)適用性的樣品可以是稀釋了的標(biāo)準(zhǔn)品、萃取基質(zhì)中的模擬樣品或者一些被選用來展示系統(tǒng)性能的樣品。這里一個(gè)重要的原則是，所選擇的系統(tǒng)適用性樣品必須可以用來測(cè)試方法中的操作是否能達(dá)到所期望的目的。無論是否需要進(jìn)行系統(tǒng)適用性測(cè)試，在常規(guī)分析之前做一次這樣的測(cè)試不失為一個(gè)明智的選擇，哪怕就只是注射一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品看看保留時(shí)間和峰大小是否和預(yù)期一樣。

09 標(biāo)準(zhǔn)品和校正品